پایان نامه با واژگان کلیدی ارزیابی کیفی، نمونه برداری، اندازه گیری

مجزا را نشان داد (منگ، 2009).
بر اساس مطالعات صورت گرفته در سال 2009 بر روی صدف آب شیرین Hyriopsis cumingii از هشت نشانگر ریزماهواره برای بررسی ساختار ژنتیکی در دو منطقه پرورشی و چهار منطقه وحشی استفاده شد که در مجموع 96 الل در شش منطقه دیده شد، نتایج تنوع ژنتیکی بالاتری را در جمعیت‌های وحشی در مقایسه با جمعیت‌های پرورشی نشان دادند در حالیکه جمعیت‌های پرورشی میزان بالاتری از درون‌آمیزی (f=0.10-0.11) را در مقایسه با جمعیت‌های وحشی (f=0.02-0.10) نشان دادند. AMOVA نشان داد که تنوع درون جمعیت‌ها 95/82 % و تنوع بین جمعیت‌ها 18/4% می‌باشد. (لی و همکاران، 2009).
نتایج حاصل از آنالیز نشانگرهای دی ان ای ریزماهواره تمایز ژنتیکی بین جمعیتهای وحشی و پرورشی گوازیمماهی (Polydactylus sexfilis) در هاوایی نشان نداد (پان و یانگ، 2010). در این مطالعه از 15 نشانگر ریزماهواره استفاده کردند که در این بین شش نشانگر که چندشکلی بالایی نشان داده بودند برای آنالیزهای بعدی استفاده شدند. در مجموع 37 آلل در سطح شش جایگاه در دو جمعیت شناسایی شد. شاخص Fst در این مطالعه 001/0 و مقدار هتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار به ترتیب 66/0 و 75/0 بهدست آمد. نتایج حاصل از آنالیز تنگنای ژنتیکی نشان داد که جمعیت هچری با تعداد کافی مولد یافت شده بهطوری که ضریب درونآمیزی بسیار پایینن (07/0-05/0) در هر دو جمعیت مشاهده شد.
ساختار جمعیتی ماهی مرمری صخرهای (Sebastiscus marmoratus) در چهار منطقه جغرافیایی با استفاده از 11 جفت نشانگرهای ریزماهواره توسط سان و همکاران (2011) بررسی گردید. 82 آلل مختلف در این مطالعه شناسایی و بازه وزنی آن از bp101 تا bp255 گزارش شد و میانگین تعداد آلل مؤثر را 43/4 بود. همچنین میانگین هتروزیگوسیتی مشاهده شده را 64/0 و هتروزیگوسیتی مورد انتظار را 65/0 اعلام کردند. شاخص جدایی جمعیتها بطور میانگین 15/0 و انحراف بالا از تعادل هاردی-واینبرگ را به دلیل هتروزیگوسیتی بالا بیان کردند.
راجاسکار و همکاران (2012) به بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتهای وحشی (دو جمعیت) و پرورشی (یک جمعیت) سوف آسیایی غولپیکر (Lates calcarifer) با استفاده از 10 نشانگر رپید (RAPD) پرداختند. در این مطالعه 589 باند مشاهده شد که 12/93% آنها چندشکلی نشان دادند. میزان تنوع ژنتیکی در جمعیتهای وحشی بیشتر از پرورشی اعلام گردید و الگوی دندروگرام با استفاده از روش UPGMA نیز دو جمعیت وحشی را بر روی یک کلاد و جمعیت پرورشی را بروی کلاد جداگانهای دیگر قرار داد.
فصل سوم
مواد و روش‌ها
3- مواد و روش‌ها
1-3- نمونه‌برداری
تعداد 140 نمونه شگماهی براشنیکووی از سواحل مناطق انزلی (E: 49°26′, N: 37°25′)، گمیشان (E: 54°04′, N: 37°04′)، محمودآباد (E: 52°15′, N: 36°37′)، میانکاله (E: 53°35′, N: 36°48′)، ساری (E: 53°03′, N: 36°33′) (هرمنطقه 28 نمونه) در پاییز تا دی ماه سال 1392با استفاده از صید پره نمونهبرداری و از هر ماهی باله دمی جهت استخراج DNA قطع و داخل تیوپهای حاوی الکل 96% فیکس شدند. سپس تمامی نمونهها به آزمایشگاه ژنتیک و بیوتکنولوژی آبزیان دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان جهت انجام آزمایشات منتقل شدند.
شکل 1-3- نقشه مناطق نمونه برداری ماهی A. braschnikowi در سواحل جنوبی دریای خزر در مطالعه حاضر
2-3- استخراج DNA
در فرآیند استخراج DNA به روش فنول- کلروفرم از محلولها و بافرهایی استفاده میشود که نحوه آماده سازی آنها در زیر آمده است:
تهیه بافر STE (Sodium Cloride , Tris. EDTA)
مواد مورد نیاز: NaCL 1/0 مولار، Tris اسیدی 05/0 مولار ، EDTA 01/0 مولار، NaOH 01/0 مولار
نحوه ساخت بافر: جهت ساخت 500 میلی‌لیتر STE، 922/2 گرم NaCl 1/0 مولار، 3 گرم تریس 05/0 مولار و 86/1 گرم EDTA 01/0 مولار را در 450 میلی‌لیتر آب مقطر دوبار تقطیر حل نموده و pH را با استفاده از محلول آب و سود به 8 رسانده و حجم نهائی به 500 میلی‌لیتر افزایش داده می‌شود.
تهیه SDS 20 درصد (سدیم دودسیل سولفات)
مواد مورد استفاده: کریستال SDS، HCL و آب مقطر
نحوه ساخت محلول: مقدار 100 گرم کریستال SDS در 450 میلی‌لیتر آب مقطر در دمای 68 درجه سانتیگراد حل گردید. با افزودن HCL، pH را به 2/7 رسانده و سپس حجم محلول به 500 میلی‌لیتر رسانده شد و در نهایت این محلول در دمای آزمایشگاه نگهداری گردید.
بافر TAE (Tris, Acetic Acid, EDTA)
مواد مورد استفاده: Na2EDTA ، Tris و اسید استیک گلاسیال
طرز تهیه: مقدار 4/48 گرم تریس در 500 میلی‌لیتر آب مقطر حل گردید، سپس 20 میلی‌لیتر Na2EDTA نیم مولار و 42/11 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال به بافر اضافه شد. حجم محلول با استفاده از آب مقطر به یک لیتر رسانده و در دمای اتاق نگهداری گردید.
آمونیوم پر سولفات25 (A.P.S)
مواد مورد استفاده: پودر آمونیوم پر سولفات ، آب مقطر.
نحوه ساخت: یک گرم پودر APS را در 10 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و و در دمای 4 درجه نگهداری می شود.
TEMED
این ماده به صورت محلول بوده و فوق العاده سمی است. TEMED دارای خاصیت کاتالیزوری جهت تسریع پلیمریزه شدن ژل آکریل است.
بافر سنگین کننده (Loading Buffer)
مواد مورد استفاده: برموفنل 1%، زایلن سیالن 1%، گلیسرول 50%
نحوه ساخت: مقدار 250 گرم برموفنل بلو با 250 گرم زایلن سیالین را در 33 میلی‌لیتر تریس 150 میلی‌مولار (6/7pH=) حل نموده و پس از آن مقدار 60 میلی لیتر از ماده گلیسرول و مقدار 7 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کرده و محلول فوق در دمای آزمایشگاه نگهداری گردید.
تهیه آکریل آمید 30 درصد
مواد مورد استفاده: آکریل آمید ، متیلن بیس اکریل آمید، آب مقطر.
طرز تهیه: 49 گرم آکریل آمید به همراه یک گرم متیلین اکریل آمید (N , N methylen bis acrylomid) در 70 میلی‌لیتر آب مقطر به 100 سی‌سی رسانده و در دمای 4 درجه نگهداری می‌شود.
تهیه TBE X 10 (Tris, Boric Acid, EDTA)
مواد مورد استفاده: تریس بازی، اسید بوریک، EDTA نیم مولار و آب مقطر.
نحوه ساخت: برای تهیه یک لیتر بافر TBE 10X، 108 گرم تریس بازی به همراه 55 گرم اسید بوریک و 40 میلی‌لیتر EDTA نیم مولار (pH=8) مخلوط نموده و حجم نهایی به وسیله آب مقطر دو بار تقطیر به یک لیتر رسانده میشود.
فنل کالیبره
فنل کالیبره با توجه به خطرات و مشکلاتی که برای آماده سازی آن وجود داشت، بصورت آماده از شرکت سیناکلون خریداری گردید.
3-3- نحوه استخراج DNA
در این مطالعه از روش فنل- کلروفرم (هیلیس و همکاران، 1996) جهت استخراج DNA استفاده شد.
مواد مورد نیاز: فنل متعادل (pH=8)، کلروفرم، ایزوامیل الکل، بافر STE، اتانول مطلق 70 درصد، پروتئیناز K، محلول SDS 20 درصد (سدیم دوسیل سولفات)، آب مقطر تزریقی و بافت مورد نظر.
وسایل مورد نیاز: قیچی، میکروسانتریفیوژ، ترمومیکسر، شیکر، تیوپ، رک، نمونه‌بردارها و نوک‌های نمونهبردار آنها با قابلیت نمونهبرداری 1000، 100 و 20 میکرولیتر، دستکش یکبار مصرف.
4-3- مراحل استخراج DNA
100 تا 500 میلی‌گرم بافت باله را در یک ویال 5/1 میلی‌لیتری استریل قرار داده شد.
اضافه کردن 500 میکرولیتر بافر STE به هر نمونه؛ اضافه کردن 30 میکرولیتر بافر SDS و 10 میکرولیتر پروتئیناز K به هر نمونه؛
فعالیت اپتیمم پروتئیناز K قلیائی و در دمای 50-60 درجه سانتیگراد می‌باشد. بدیم منظور تیوپ‌ها را در ترمومیکسر با دمای 55 درجه سانتیگراد با تعداد دور rpm600 به مدت 5 تا 24 ساعت قرار گرفتند تا بافتها بطور کامل هموژن شوند و به صورت امولسیون غلیظ درآیند.
4- سپس بهمنظور جداسازی پروتئین از بافت و حل نمودن چربیها به هر تیوب 500 میکرولیتر فنل اشباء (8=pH) اضافه شد. تیوبها چند بار با ورتکس مخلوط شده و بمدت 30-20 دقیقه شیکر شده و سپس با دور 13000 و بمدت 10 دقیقه سانتریفوژ گردیدند.
5- سپس فاز بالایی به آرامی توسط یک نمونه بردار با ظرفیت کم (20 تا 50 میکرو لیتر) با دقت جدا و در داخل تیوب جدیدی انتقال داده شد. برای حذف فنل باقی مانده به هر تیوپ جدید 500 میکرو لیتر کلروفرم اضافه شد و سپس بمدت 20 دقیقه شیکر شده و بدنبال آن سانتریفوژ13000 دور بمدت 10 دقیقه انجام گردید. سپس مجددا فاز رویی جدا و به داخل تیوپ جدیدی انتقال یافت و به هر تیوپ جدید 800 میکرولیتر اتانول مطلق سرد اضافه گردید.
6- به هر نمونه 40 میکرولیتر استات سدیم سه مولار اضافه شده و سپس به آرامی تیوب‌ها را سرو ته نموده و بدنبال آن سانتریفوژ بادور گردش13000 دور بمدت 15 دقیقه انجام گردید. بعد از اتمام سانتریفوژ بر کف تیوب رسوب سفیدرنگ DNA دیده شد.
7- الکل و استات را دور ریخته و به هر تیوپ 200 میکرولیتر الکل 70% اضافه شد، سپس به مدت دو دقیقه عمل سانتریفیوژ با سرعت 13000 دور صورت گرفت. پس از آن الکل را خالی و اقدام به خشک نمودن تیوبها گردید. جهت تبخیر کامل الکل، تیوبهای حاوی DNA بمدت 15 الی 20 دقیقه در دمای 50 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور قرار داده شدند بطوری که در انتها تیوبها بوی الکل نمیدادند.
8- بعد از خشک شدن کامل تیوب و رسوب DNA، مقدار 100 میکرو لیتر آب مقطر استریل به هر یک از تیوبها اضافه گردید و به مدت 30 دقیق در بنماری با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا DNA استخراجی بطور کامل حل شود و قطعات RNA باقیمانده نیز هضم شوند. پس از این مدت تیوبهای حاویDNA در فریزر با دمای 20- نگهداری گردیدند.
5-3- ارزیابی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده
کیفیت DNA استخراجی با استفاده از ژل آگاروز یک درصد و کمیت آن نیز با استفاده از روش اسپکتروفتومتری بررسی گردید.
ارزیابی کمیت DNA استخراج شده با استفاده از روش اسپکتروفتومتری
تجهیزات مورد نیاز: دستگاه بیوفتومتر
روش ارزیابی: برای تعیین کمیت DNA نمونه‌ها پس از کالیبره کردن دستگاه اسپکتروفتومتر با آب مقطر، 20 میکرولیتر DNA ژنومی به وسیله آب مقطر به حجم 300 میکرولیتر رسانده شد، مقدار جذب نوری نمونهها در طول موج 260 تا 280 نانومتر و نسبت جذب در طول موج 260 نانومتر به طول موج 280 نانومتر به وسیله دستگاه اندازه گیری و ثبت گردید. غلظت DNA با استفاده از رابطه زیر محاسبه گردید:
= 50 × D × OD260 (ng / ml) غلظت DNA
OD: میزان جذب نوری در طول موج 260 نانومتر
D: نسبت رقت
چنانچه نسبت جذب 2-8/1A1/A2 = باشد، مقدارDNA مناسب است و اگر این نسبت بیشتر از 2 باشد، بیانگر این مطلب است که DNA استخراجی دارای ناخالصی RNA است و اگر نسبت جذب کمتر از 8/1 باشد، نشان دهنده ناخالصی بهعلت حضور فنل و پروتئین در DNA استخراجی است.
پروتئین معمولاً در 280 نانومتر و پلی‌ساکاریدها در 230 نانومتر جذب زیادی دارند. بنابراین می‌توان میزان آلودگی محصول به پروتئین و هیدراتهای کربن‌را از طریق میزان این جذب‌ها تشخیص داد.
شکل 2-3- تصویر بیوفتومتر مورد استفاده در مطالعه حاضر
6-3- ارزیابی کیفیت DNA با استفاده از الکتروفورز افقی ژل آگارز یک درصد
مواد مورد نیاز: بافر TAE با غلظت X10 (تریس استات)، پودر آگارز، بافر سنگین کننده (Loading buffer)، اتیدیوم بروماید 1%
وسایل مورد نیاز: نمونه‌بردارها، سینی ژل و شانه‌های آن، دستگاه UV، الکتروفورز افقی، دستگاه مستند ساز ژل.
روش ارزیابی:
تانک الکتروفورز ژل شستشو داده شد و خشک گردید.
سینی مخصوص ژل را بر روی مسطح صاف قرار داده و شانه روی ژل قرار داده شده تا چاهکها جهت تزریق DNA ایجاد شوند.
برای تهیه ژل آگارز یک درصد ابتدا 4/0 گرم پودر آگارز وزن کرده و سپس 36 میلی لیتر

دیدگاهتان را بنویسید